將32 P標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘，迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。
雜交結束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×SSC和0.1% SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉一次。重復洗 一次，同時應避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進行自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
原位雜交技術的實驗結果
原位雜交技術的實驗結果包括陽性信號和陰性信號的判斷標準。陽性信號是指探針與目標核酸序列特異性結合形成的雙鏈復合物，在顯色反應、熒光染色或性同位素標記下呈現出明顯的信號。陰性信號是指探針未與目標核酸序列結合，不呈現任何信號。實驗結果的分析需要結合探針的特異性和敏感性、組織或細胞的原始結構以及實驗條件等因素綜合進行。
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