DNA 探針為原位雜交提供較高的靈敏度。與RNA探針相比,DNA探針與靶mRNA 分子的雜交強度較弱,因此在雜交后的洗滌中不應使用甲醛。
探針特異性至關重要。如果已知細胞中mRNA或DNA的確切核苷酸序列,則可據此設計高度的互補探針。如果超過 5% 的堿基對不互補,那么探針只能與靶序列發生輕度雜交。這意味著,探針更容易在洗滌和檢測步驟中被洗去,可能無法正確檢測。
原位雜交雜交液
(一)雜交液內除含一定濃度的標記探針外,還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛白蛋白及載體DNA或RNA等。
(二)雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加,可以減低探針與組織標本之間的靜電結合。
(三)賈酰胺可使雜交溫度降低,所以雜交液中加入適量的甲酰胺,可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態結構的破壞以及標本的脫落。
(四)硫酸葡聚糖能與水結合,從而減少雜交液的有效容積,提高探針有效濃度,以達到提高雜交率的目的。
熒光原位雜交(FISH)技術具有以下優點:
高特異性:熒光探針的合成是定向的,保證了雜交過程的特異性,可以有效地降低非特異性雜交和背景干擾。
高靈敏度:熒光信號的檢測比性信號的檢測更靈敏,可以檢測出低拷貝數的DNA序列,甚至可以檢測單個基因序列。
快速簡便:FISH技術操作簡便,雜交過程可以在數小時或數天內完成,而且不需要過于復雜的設備,便于在實驗室開展。