原位雜交-貝科新肽(推薦商家)-原位雜交公司
武漢貝科新肽科技有限公司
- 主營產品：原位雜交,亞細胞定位,蛋白互作,啟動子篩選
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熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH）是在20世紀80年代末在性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非性分子細胞遺傳技術，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導分子（reporter molecule）結合，雜交后再通過細胞化學過程連接上熒光染料.FISH的基本原理是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯的單與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優點，不但能顯示中期分裂相，還能顯示于間期核.同時在熒光原位雜交基礎上又發展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質纖維熒光原位雜交技術.
和其它實驗方法一樣，必須同時設對照試驗以證明其實驗結果特異性。對照試驗的設置須根據核酸探針和靶核苷酸的種類和現有的可能條件去選定。ISHH的優點是它的高度特異性，它可測定組織、培養的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。應用高敏感度的性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mRNA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。由于雙鏈DNA的穩定性，在用ISHH定位DNA時很少發生丟失，降解，其敏感性高到能夠顯示在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此，對ISHH結果的解釋應持慎重態度，特別是前人未報告過的新發現。
一. 原位雜交天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分鐘。
2） 置換成30％的PBST溶液，放置5分鐘
3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次
4） 置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定（本實驗不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織，以便于雜交。
2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
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