原位雜交:
原位雜交是指用特定探針定位、檢測DNA、RNA的一種有效的實驗方法,通過把特點序列客隆到特殊載體上,通過轉錄酶反轉一條天然的RNA探針,將探針和切片樣品進行雜交,通過一系列顯色方法,來確定RNA或者DNA表達區域;本中心原位雜交探針采用的是第高辛和生物素標記,靈敏度和同位素相當。 我們采用roche標記及顯色試劑盒,GISH/ISH/FISH按照探針進行收費,每個試劑盒每條探針可以雜交60-80張玻片,收費為1萬5千元,GISH雜交因需要加抗淬滅劑每條探針收費為1萬9千元。量大優惠!
菌落的裂解及DNA結合于纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜,再重復一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時,固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標記的RNA進行雜交。
將32 P標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間,盛濾膜的容器應蓋嚴,以防液體蒸發。
雜交結束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘,并將濾膜至少翻轉一次。重復洗 一次,同時應避免膜干涸。
68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。