原位雜交第三天
1） 用1ml含10％熱滅清的MABT溶液置換溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時以上，后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。
2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，室溫下顯色。
4）每隔一小時觀察胚胎是否開始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。
生物領域應用原位雜交技術的例子：
物種進化與系統發生學研究：在物種進化與系統發生學研究中，原位雜交技術可以用于檢測物種之間的親緣關系和進化歷程。例如，可以比較不同物種之間特定基因序列的差異，進而研究它們的親緣關系和進化歷程。
原位雜交技術在基因表達和調控、細胞分化與發育、研究和物種進化與系統發生學等領域都有廣泛的應用價值，為深入探究生命現象、促進生物技術的發展提供了有力的技術支持。
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