RFLP標記是發展最早的DNA標記技術。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、點突變所引起的。利用這一方法可以測定種群內、種群間不同水平的物種在不同環境下進化水平上的差異。RFLP技術在用于基因型分型研究的同時，同樣可用于在不同環境中微生物多樣性的研究。 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態性)，是用特異性引物對混合微生物群體DNA提取物進行PCR擴增，然后用適當的限制性內切酶對擴增產物進行 消化，由于序列的差異，呈現酶切圖譜的 DNA多態性。該方法已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。T-RFLP技術依據細菌16S rRNA基因保守區設計通用引物，以待分析樣品DNA為模板進行PCR擴增，所得到的PCR產物采用特定的的限制性內切酶進行酶切。由于在細菌之間16S rRNA序列中核苷酸序列的差異，酶切后會產生很多不同長度的限制性片段。通過檢測分析這些酶切片段大小即可反應微生物群落組成情況。
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