亞細(xì)胞定位常見問題 細(xì)胞是構(gòu)成生物體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)復(fù)雜精巧且高度有序，根據(jù)功能和空間分布的不同，細(xì)胞內(nèi)部可以進(jìn)一步劃分為不同的細(xì)胞區(qū)域或細(xì)胞器，即亞細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)只能通過電子顯微鏡才能觀察。常見亞細(xì)胞有細(xì)胞核、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體等。每種亞細(xì)胞中都存在一組特定的蛋白質(zhì)，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)為這些蛋白質(zhì)行使功能提供了相對獨(dú)立的生命活動場所。蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過翻譯并合成，由蛋白質(zhì)分選信號引導(dǎo)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的亞細(xì)胞中以參與細(xì)胞的各種生命活動，這一過程就稱為蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

原理簡介

GFP、RFP等熒光蛋白因其獨(dú)特的熒光性質(zhì)和靈敏性，常作為報(bào)告基因研究并分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位和相互作用等。將目標(biāo)蛋白與熒光蛋白的N端或者C端融合，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)或穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，使得該融合蛋白在受體材料細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，目標(biāo)蛋白會牽引熒光蛋白一起定位到目標(biāo)細(xì)胞器，通過顯微鏡觀察熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)顯示的位置，確定目標(biāo)蛋白的位置，從而確定目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

常見問題答疑

1、構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體時(shí)，GFP融合位置為什么有N端、C端之分？

若序列中存在信號肽，則構(gòu)建載體時(shí)需避開這一端來融合熒光蛋白。需注意不同的融合方式可能會得到不同的定位結(jié)果，例如融合在熒光蛋白N端的目標(biāo)蛋白一般無法得到過氧化物酶體的定位結(jié)果；融合在熒光蛋白C端的目標(biāo)蛋白一般無法得到線粒體、質(zhì)體的定位結(jié)果。

2、為什么不同的受體材料有時(shí)得到的定位結(jié)果不一樣？

不同物種的細(xì)胞在翻譯表達(dá)基因時(shí)，其表達(dá)模式和影響因子不同。受物種差異的影響，同一個(gè)載體在不同的受體材料中表達(dá)的位置可能不同，因此建議實(shí)驗(yàn)時(shí)盡可能選用與目的基因來源相近的受體材料進(jìn)行表達(dá)。

3、用水稻原生質(zhì)體進(jìn)行亞細(xì)胞定位時(shí)，為什么不拍攝葉綠體的自發(fā)熒光？

經(jīng)測驗(yàn)，使用水稻黃化苗制備原生質(zhì)體，載體轉(zhuǎn)化效率及基因表達(dá)強(qiáng)度較高，而黃化苗中葉綠體較少，因此水稻原生質(zhì)體定位拍照時(shí)，除非與葉綠體共定位，否則不拍攝葉綠體的自發(fā)熒光。

4、為什么要提供GFP空載的對照圖片？

（1）作為整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的操作參照，可排除因?qū)嶒?yàn)操作而導(dǎo)致目的基因沒有熒光信號的影響。

（2）作為載體體系的參照，確認(rèn)構(gòu)建載體時(shí)所使用的載體是可正常表達(dá)熒光蛋白的。

5、為什么有的共定位圖片中葉綠體通道是玫紅色？

在擬南芥、煙草、玉米、大麥、小麥等材料中，種植培養(yǎng)苗子時(shí)是正常接受光照的，葉片中含有大量葉綠體，而葉綠素在640nm左右的激發(fā)光下可產(chǎn)生紅色的自發(fā)熒光。當(dāng)在這些含葉綠體較多的受體材料中做共定位實(shí)驗(yàn)時(shí)，共定位marker一般為紅色熒光（在560nm左右的激發(fā)光下），實(shí)驗(yàn)及共聚焦拍攝時(shí)兩個(gè)波長通道的熒光互不影響，但視野下看著比較混淆，尤其疊加后二者不易分清，因此只是在顏色顯示上將葉綠體自發(fā)熒光設(shè)置為玫紅色，以顯示和共定位marker的區(qū)別。

6、為什么有的基因定位結(jié)果與預(yù)想的不一致？

對于一個(gè)特定的定位載體，只要熒光表達(dá)較好，其定位結(jié)果是確定的，不會隨人為意愿或操作而改變。至于有時(shí)候和預(yù)想的結(jié)果不一樣，可能和蛋白本身、選擇的表達(dá)載體以及熒光蛋白融合方式等有關(guān)。

7、為什么有的普通定位結(jié)果出來后無法準(zhǔn)確判斷其定位位置？

細(xì)胞中的細(xì)胞器復(fù)雜且多樣，除一些常見的、特征比較明顯的細(xì)胞器外，有些細(xì)胞器在激光共聚焦下形狀比較相似，例如：線粒體、過氧化物酶體、高爾基體等細(xì)胞器，它們的熒光表達(dá)形狀可能都是點(diǎn)狀，因此不易區(qū)分。這時(shí)可以結(jié)合基因的其他功能研究來判斷其可能表達(dá)的位置。另外，蛋白表達(dá)本身也是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多個(gè)合成場所及轉(zhuǎn)運(yùn)過程，自身表達(dá)情況可能比較復(fù)雜，因此不易判斷具體的表達(dá)位置。

8、為什么不先對一個(gè)基因做預(yù)測，在預(yù)測的結(jié)果上直接做共定位？

不同的預(yù)測網(wǎng)站有不同的計(jì)算方法，同一個(gè)基因在不同的預(yù)測網(wǎng)站也可能得出不同的定位結(jié)果。另外所有的結(jié)果都應(yīng)是基于實(shí)驗(yàn)得到的，對于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推薦先做普通定位，根據(jù)普通定位的結(jié)果再決定做哪種細(xì)胞器的共定位。

9、為什么有的基因做原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)熒光蛋白不亮？

不同物種的細(xì)胞可能對基因表達(dá)有影響，當(dāng)在一種材料的原生質(zhì)體中觀察不到熒光時(shí)，可以考慮換一種受體材料。另外，如果是分泌蛋白，在原生質(zhì)體中無法觀察到熒光，此時(shí)可以考慮注射煙草葉片來觀察熒光。

10、拍攝時(shí)為什么有明場通道？

（1）顯示細(xì)胞狀態(tài)，有活力的原生質(zhì)體細(xì)胞應(yīng)該是飽滿圓潤的，變形或破碎的細(xì)胞說明此時(shí)細(xì)胞不是適狀態(tài)或細(xì)胞已死亡。

（2）顯示熒光確實(shí)是細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的，而不是細(xì)胞碎片及雜質(zhì)產(chǎn)生的雜光。